1. 고정액 (fixative)

1. 알데히드 (aldehyde)계 고정액

오스뮴산의 전고정, 조직화학 등에 사용된다. 알데히드로서는 포름알데히드, 아크로레인, 글루타르알데히드가 있는데 글루타르알데히드가 일반적으로 널리 사용되고 있다.

1) 글루타르알데히드 (glutaraldehyde, CHO(CH2)3CHO)

알데히드는 불안정하여, 공기에 의하여 산화되어 유기산을 생성한다. 또 빛에 의하여 산화가 촉진되어 중합이 일어난다. 이 때문에 사용할때에는, 활성탄처리에 의하여 불순물을 제거하고, pH를 회복시켜주는 것이 필요하다. 통상 25%수용액으로 시판되고 있다.

3% 인산완충액 (Sabatini et al. , '63)

1. 0.2M NaH2POH2O (27.6g/1) 23ml

0.2M Na2HPO4·H2O (35.6g/1) 77ml

양자를 혼합하여, 증류수로 200ml되게한다.(pH7.3, 0.1M)

상기의 인산완충제에 25%글루타르 알데히드12ml를 가하고, 100ml되게한다.

3.냉장보존하며, 신선한 상태에서 사용한다.

2) 포름 알데히드 (formaldehyde, HCOH)

a)메타놀 free 포르말린

A액: NaH2POH2O (22.6g/1)

B액: NaOH (25.2g/1)

①액 A액 41.5ml + B액 8.5ml (pH7.5)

②액 paraformaldhyde(분말) (40g/100ml)

②의 액을 60 - 65℃ 에 가열후 ,40% NaOH를 액이 투명해질때까지 적하하고, 그

후에, 5.4g의 글루코스를 가한다.

고정액:①액 45ml +②액 15ml(약 4% formaldehyde액 pH7.4)

b) 인산완충포름 알데히드액 (中川.山本, '70)

(4% formaldehyde in 0.5M phosphate buffer sol.)

A액: Na2HPO4 57.5 g

Paraformaldehyde 40.00g

증류수 800ml

60-65℃ 에 용해한다. (약 20분)

B액: NaH2PO4·2H2O 1.48g

(NaH2PO4·H2O 1.31g)

고정액: A액에 B액을 가하여, 전체가 1,000ml이 되게 한다.

3) 아크로레인 (acrelein; CH2=(HCHO)

조직으로의 침투성이 크고 고정작용도 강해서, 약간 큰 조직편도 고정할 수 있다.

자극취가 강하고 독성도 강하다.

고정액: 0.05-0.1M 인산 완충액으로 희석한 10% 아크로레인 용액(ph 7.2-7.5)으로 사용하낟. 실온에서 15-45분 고정.

2. 과망간산 칼륨 (KMnO4)계 고정액

일반적으로 막 구조가 잘 고정된다. 식물 조직의 고정에 사용된다.

a) LUFT액 ('56)

고정액: 1.2% KMnO4 액 1 Vol.

0.14M 초산 베로날 buffer sol. 1 Vol.

(PALADE 액 참조) pH 7.4-7.6 15분 - 2시간 고정

b) MOLLENHAUER 액 ('60)

고정액 : 비완층 2.5 -5.0%KMnO4 으로써 사용한다. 실온 2시간 고정

3. 오스뮴산 (Osumium tetraoxide: OsO4)계 고정액

a)PALADE액 ('52)

A액: Stock buffer solution pH7.4 장기간 보존 가능

0.14M 베로날 Sodium veronal 1.47g

초산염완충액 (약용성 바르비탈)

Sodium acetate 9.4g

증류수를 가해서 500ml로한다.

B액: Stock Osumium tetraoxide 액( 2% 오스뮴액)

고정액: A액 5ml (2 Vol.)

0.1N(HCl) 5ml (2 Vol.)

증류수 2.5ml (1 Vol.)

B액 12.5ml(5 Vol.)

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25.0ml

*본 고정에서의 pH는 0.14M 베로날 . 초산염 완충액 10ml에 대해서 첨가하는 0.1N

0.1N HCL(ml)

4

6

8

10

11

12

13

PH(25℃)

81.8

79.0

7.66

7.42

7.25

6.99

6.75

HCl의 양에 의하여 조절할 수 있다.

0.1N HCl :농산염 36%(8.6ml)를 증류수 1000ml에 희석한다.

b) CAULFIELD액 ('57)

PALADE 액은 저장액이므로, 이것에 sucrose를 가해서 등장한 것 .

고정액 A액 1 Vol.

0.1N HCl 1 Vol.

증류수 2 Vol.

B액 4 Vol.

Sucrose 0.045g/ml

c) MILLONIG액 (볍법) ('61)

고정액 :2.76% NaH2POH2O 7ml

3.56% NaHPO2H2O 43ml

2% OsO4 Solustion 50ml

d) MILLONIG 액 ('62)

MILLONIG의 인산완충액에 의하여 완충한 오스뮴산고정액

A액 :2.26% 인산 나트륨( NaH2POH2O)수용액

B액 :2.52%수산화나트륨 수용액

고정액:pH7.4

A액: 41.5ml

B액: 8.5ml

5.4%Glucose액 5.0ml

오스뮴산 0.5g

고정시간 (0-4℃)

일반 생물 시료(1-2mm크기) 1.5-2시간

세균 24시간

유리세포 5-15분

4. 글루타르 알데히드 . 오스뮴산 이중고정

1) 일반적인 방법

i)글루타르알데히드로 0-4℃ 4.5-2시간

ii) 인산 buffer sol.으로 rinse, 3change, 30분 -overnight

iii) 오스뮴산 (MILLONIG액 )으로 1-1.5시간 고정

2)글루타르알데히드 .오스뮴산 혼합 고정액 (黑住,'70)

(25%글루타르알데히드, 2%오스뮴산액,pH7.4)

A액: 6%오스뮴산 3.3ml

veronal buffer 4.2ml(PALDADE액 참조)

자당 (sucrose) 0.45g (냉혈동물 0.3g)

B액 :10%글루타르알데히드 2.5ml