투과형 전현용 시료 작제법

1. 고정액 (fixative)

1. 알데히드 (aldehyde)계 고정액

오스뮴산의 전고정, 조직화학 등에 사용된다. 알데히드로서는 포름알데히드, 아크로레인, 글루타르알데히드가 있는데 글루타르알데히드가 일반적으로 널리 사용되고 있다.

1) 글루타르알데히드 (glutaraldehyde, CHO(CH2)3CHO)

알데히드는 불안정하여, 공기에 의하여 산화되어 유기산을 생성한다. 또 빛에 의하여 산화가 촉진되어 중합이 일어난다. 이 때문에 사용할때에는, 활성탄처리에 의하여 불순물을 제거하고, pH를 회복시켜주는 것이 필요하다. 통상 25%수용액으로 시판되고 있다.

3% 인산완충액 (Sabatini et al. , '63)

1. 0.2M NaH2POH2O (27.6g/1) 23ml

0.2M Na2HPO4·H2O (35.6g/1) 77ml

양자를 혼합하여, 증류수로 200ml되게한다.(pH7.3, 0.1M)

상기의 인산완충제에 25%글루타르 알데히드12ml를 가하고, 100ml되게한다.

3.냉장보존하며, 신선한 상태에서 사용한다.

2) 포름 알데히드 (formaldehyde, HCOH)

a)메타놀 free 포르말린

A액: NaH2POH2O (22.6g/1)

B액: NaOH (25.2g/1)

①액 A액 41.5ml + B액 8.5ml (pH7.5)

②액 paraformaldhyde(분말) (40g/100ml)

②의 액을 60 - 65℃ 에 가열후 ,40% NaOH를 액이 투명해질때까지 적하하고, 그

후에, 5.4g의 글루코스를 가한다.

고정액:①액 45ml +②액 15ml(약 4% formaldehyde액 pH7.4)

b) 인산완충포름 알데히드액 (中川.山本, '70)

(4% formaldehyde in 0.5M phosphate buffer sol.)

A액: Na2HPO4 57.5 g

Paraformaldehyde 40.00g

증류수 800ml

60-65℃ 에 용해한다. (약 20분)

B액: NaH2PO4·2H2O 1.48g

(NaH2PO4·H2O 1.31g)

고정액: A액에 B액을 가하여, 전체가 1,000ml이 되게 한다.

3) 아크로레인 (acrelein; CH2=(HCHO)

조직으로의 침투성이 크고 고정작용도 강해서, 약간 큰 조직편도 고정할 수 있다.

자극취가 강하고 독성도 강하다.

고정액: 0.05-0.1M 인산 완충액으로 희석한 10% 아크로레인 용액(ph 7.2-7.5)으로 사용하낟. 실온에서 15-45분 고정.

2. 과망간산 칼륨 (KMnO4)계 고정액

일반적으로 막 구조가 잘 고정된다. 식물 조직의 고정에 사용된다.

a) LUFT액 ('56)

고정액: 1.2% KMnO4 액 1 Vol.

0.14M 초산 베로날 buffer sol. 1 Vol.

(PALADE 액 참조) pH 7.4-7.6 15분 - 2시간 고정

b) MOLLENHAUER 액 ('60)

고정액 : 비완층 2.5 -5.0%KMnO4 으로써 사용한다. 실온 2시간 고정

3. 오스뮴산 (Osumium tetraoxide: OsO4)계 고정액

a)PALADE액 ('52)

A액: Stock buffer solution pH7.4 장기간 보존 가능

0.14M 베로날 Sodium veronal 1.47g

초산염완충액 (약용성 바르비탈)

Sodium acetate 9.4g

증류수를 가해서 500ml로한다.

B액: Stock Osumium tetraoxide 액( 2% 오스뮴액)

고정액: A액 5ml (2 Vol.)

0.1N(HCl) 5ml (2 Vol.)

증류수 2.5ml (1 Vol.)

B액 12.5ml(5 Vol.)

─────────────────────────────

25.0ml

*본 고정에서의 pH는 0.14M 베로날 . 초산염 완충액 10ml에 대해서 첨가하는 0.1N

0.1N HCL(ml)

4

6

8

10

11

12

13

PH(25℃)

81.8

79.0

7.66

7.42

7.25

6.99

6.75

HCl의 양에 의하여 조절할 수 있다.

0.1N HCl :농산염 36%(8.6ml)를 증류수 1000ml에 희석한다.

b) CAULFIELD액 ('57)

PALADE 액은 저장액이므로, 이것에 sucrose를 가해서 등장한 것 .

고정액 A액 1 Vol.

0.1N HCl 1 Vol.

증류수 2 Vol.

B액 4 Vol.

Sucrose 0.045g/ml

c) MILLONIG액 (볍법) ('61)

고정액 :2.76% NaH2POH2O 7ml

3.56% NaHPO2H2O 43ml

2% OsO4 Solustion 50ml

d) MILLONIG 액 ('62)

MILLONIG의 인산완충액에 의하여 완충한 오스뮴산고정액

A액 :2.26% 인산 나트륨( NaH2POH2O)수용액

B액 :2.52%수산화나트륨 수용액

고정액:pH7.4

A액: 41.5ml

B액: 8.5ml

5.4%Glucose액 5.0ml

오스뮴산 0.5g

고정시간 (0-4℃)

일반 생물 시료(1-2mm크기) 1.5-2시간

세균 24시간

유리세포 5-15분

4. 글루타르 알데히드 . 오스뮴산 이중고정

1) 일반적인 방법

i)글루타르알데히드로 0-4℃ 4.5-2시간

ii) 인산 buffer sol.으로 rinse, 3change, 30분 -overnight

iii) 오스뮴산 (MILLONIG액 )으로 1-1.5시간 고정

2)글루타르알데히드 .오스뮴산 혼합 고정액 (黑住,'70)

(25%글루타르알데히드, 2%오스뮴산액,pH7.4)

A액: 6%오스뮴산 3.3ml

veronal buffer 4.2ml(PALDADE액 참조)

자당 (sucrose) 0.45g (냉혈동물 0.3g)

B액 :10%글루타르알데히드 2.5ml

Ⅱ. 탈수법 (dehydration)과 포매법(embedding)

1)Alcohol계열 (LUFT)에 의한 탈수법

30% Alcohol(Ethanol) 15/20회┐─70%

50% " "

70% " " 냉장

80% " "

90% " " ┘

100%-Ⅰ Alcohol(Ethanol) 15/20회

100%-Ⅱ " "

Propylene oxide(PO)-Ⅰ 15/20회

" -Ⅱ "

PO + Epon mixture(1: 1) 1시간

Epon mixture 1시간

Embedding

*overnight가 필요한 경우에는,70% Alcohol에서 냉장고내에, 또는 Epon mixture 내에서

행할 것.

2)Aceton계열에 의한 탈수법

30% Acenton 20분 생략가능

50% " "

70% " "

80% " "

90% " "

100%-Ⅰ " "

100%-Ⅱ Acenton + Epon mixture 1시간

Epon mixture -Ⅰ 1-2시간

" -Ⅱ "

" -Ⅲ "

Embedding







Ⅲ. 포매제 (Embedding mediums)

애폭시 수지 포매법에 있어서 포매제의 조성과 포매조작


LUFT법

申田法

에폭시 수지

Quetol 812

Epok 533 100ml

경화제

DDSA MNA

MNA 86ml

가속제

경도의 조절

DMP-30

A : Quetol-812 62ml

DDSA 100ml

B : quetol-812 100ml

MNA 89ml

적당한 경도 : A:B=6:4-4:6

A(연하다), B(강하다)

DMP-30 (1.5-2.0%)

적당한 경도 : 상기혼합액

연하게 한다 : Polythylen

glycol 200ml를 가한다.

강하게한다 : LUFT B액을 가한다.

경도의 조절의 차

A, B의 배합변경

PEG, LUFT B액의 량

경화조건

35℃ overnight

40℃ 다음 1일

60℃ 다음밤

50℃ 50시간

탈수

포매

알콜계열

1) 프로필렌 옥사이드 30분 2회

2) PO + Epon mix (1:1) 1시간

3) 제라틴캅셀내에서 가열경화

알콜계열

1) 알콜 BGE 15-30분

2) BGE 15-30분

3) BGE + mixture (1:1) 1시간

4) Mixture 1-2시간

5) 젤라틴 캅셀이내에서 가열경화

BGE : n-Butyl glycidyl ether











포매수지

Mixture A(연)

Mixturen B(경)

경도

3

7

5

5

7

3

열중합 : I) 45℃에서 overnight

ii) 60℃ 3일

○ mixture A 및 B는 0℃에서 수주간 보존가능, 습기 불가

○ A, B, DMP-30을 Mix 한 것은 0℃에서 1주일간 보존 가능, 밀폐주사기내

Quetol mixture 의 간단한 조합법


Quetol mixture 의 총량 (ml) A : B = 5 : 5

20

30

50

60

100

130

250

Quetol-812

9.1

13.7

22.8

27.4

45.6

59.3

114

DDSA

6.2

9.3

15.4

18.7

30.8

40.1

77

MNA

4.6

7.0

11.8

13.9

23.6

30.6

59

DNP-30

0.3

0.45

0.75

0.9

1.5

1.95

3.75

Sample 수

1

2

3-4

5

8-9

10-12

22-24


*1 sample중의 조직편 10개이내, 젤라틴캅셀 No.10, 일반적으로 1 sample에

약 10cc 필요

Ⅳ. 시료 지지막의 제작법

포매수지는 일반적으로 전자선에 조사에의하므로, 그 절편은 지지막 위에 올려서 전자현미경으로 검경한다. 게다가 수지의 승화를 방지하기위하여 절편의 중위에 카본증착을 하는 경우도 있다. 그러나 전자선조사에 강한 에폭시수지등의 절편은 지지막이 없어도 충분히 검경 할 수 있으므로 이러한 경우 에는 집착처리 한 sheet mesh(세말한철망)에 직접 올려서 검경한다.

1. 메시(mesh)

·통상, 구리의 얇은 판에 구멍이 나있는 판성의 mesh가 사용된다. 이것들의 직경은 전나현미경의 시료 직통에 맞도록3mm로 통일되어있다.

·재질은 구리외에도 니켈 맥금 스테인레스 몰리브덴등이있다.size는 75-1,000 mesh의사이의 각 단계의 것들이다.

·구멍의 모양은 원,사각,직사각형, 6각등이있다. 기타0.1-0.6mm의직경의구멍이1개있는단공 mesh나 정방향의 구멍이몇게늘어서있는slitmesh도

시판되고 있다.

·세계적으로는 spec imen grid혹은 specimenscreen이라고 불리고 있다.

2. 시료 지지막

시료 지지막으로서는 다음의 특성을 가질 것을 요구된다.

1) 수백 옹스트롱(Å)이하의 균일한 두께 박막으로 되어 있을 것.

2) 전자선에 대하여 강인할 것

3) 표면이 무구조일 것

4) 시료를 지지하기 쉬운 표면을 가질 것

5)제작이 용이할 것

·일반적으로 사용되고있는 지지막은 콜로디온(collodion), 포름발(폴리비닐포말), 카본등의 박막이 있다. 또한 지지막을 보강할 목적으로 콜로디온, 포름발의 지지막위에 얇게 진공 증착한 것도 사용한다.

A. 콜로디온 지지막(von Ardenne, '42)

·피막형성능이 좋고, 지지막으로서 가장 오랜 역사를 갖고 있고, 현재도 널리 사용되고 있다.

(작제법)

. 삼발이 위에 얹은 글라스 샤레(직경 15㎝이상), 또는 뷰나로트에 절반 정도 증류수를 넣고 글라스 등에 붙여 놓은 mesh를 수증에 넣고, 바닥에서 1㎝높이의 대위에 놓고 버너로 증류수의 온도가 35-50℃될때까지 가열하여,1.0-2.0%콜로디온 초산아밀 용액을 피펫에 넣어, 수면 중앙에 한방울 떨어뜨린다. 액은 빠르게 퍼지고, 용매가 휘발한 후에 막이 생긴다. 사이폰 등을 이용하여 물을 빼내서, 수면을 낮춤으로써 sheet mesh에 부착시칸다. 물을 전부 유출 시킨후. 대를 그대로 건조하여 보존한다.

·그외에 슬라이드 위에 콜로디온 박막을 펴서 행하는 건식법이 있다. 아주 청결한 슬라이드글라스를 수평으로 유지하고 그위에다 콜로디온 용액(0.3-0.7%)를 소량 흐르게하여 퍼뜨린다. 빨리 슬라이드글라스를 수직으로 바꾸어 놓는다. 조금지나서 밑에 고인 과잉액을 여지로 빨아내어, 다시 수평으로 원위치 시키고 용매를 휘발 시켜, 슬라이드글라스 가장자리부터 기울여서 증류수에 담그어 가면 콜로디온막은 글라스의 면에서 떨어져서 수면에 부유한다. 이 막위에 sheet mesh를 슬라이드글라스가 덮어 씌우듯이 올려서 늘어놓는다.sheet mesh가 올려져 있는 박막 한쪽끝에 위에서부터 슬라이드글라스를 붙여서 수직으로 수중에 넣으면, 슬라이드글라스 위에 콜로디온 박막에 덮어진 sheet mesh가 부착한다. 수중에서 슬라이드글라스위에 sheet mesh가 있도록 방향을 바꾸어서 수중으로부터 꺼내어 여분으로 붙어있는 물을 여지에 흡착시켜 건조 보존한다.

B. 포름발 지지막 (폴리비닐 포말, Schaefer and Harker ; '94)

. 기계적강도 내구성이뛰어나다.

. 건식법으로 제작하지만 0.1-0.5%(중량)의 염화에틸렌 또는 클로로포롬 용액으로 하여

콜로디온 막의 경우와 똑같이 행한다.

C. 카본지지막

. sheet mesh에 콜로디언 또는 포름발 지지막을 붙이고, 그것들의 막 위에 진공으로 카본증착을

행한후 용매로 콜로디온 또는 포름발을 용해한다.

3. 마이크로 mesh

. 여러 가지 지지막은 콘트라스트 및 해상도를 저하시키기 때문에 지지막이

없는 것이 좋다.Epoxy수지에 포매된절편은 직접 마이크로 mesh ,

sheet mesh 에 올려놓고 관찰하는 일이 있다.

A. 아미크로 mesh는 마이크로리드 라고도 불리우며 전현의 조정(비점수차의 보정)에

흔히 사용된다.미생물 시료 등과 같이 약 40,000배 이상에서 관차하는 시료의 지지망 으로써

없어서는 안되는 mesh이다.

(조작법)

1) 큰 샤레에 증류수를 넣고, 작은 샤레에 아세톤을 넣어 놓는다.

큰 샤레에 금속대를 넣고 그위에 슬라이드글라스를 놓는다.

2) mesh를 1매씩 핀셋으로 집어서 아세톤에 세정한후에 슬라이드글라스에 늘어놓는다.

3) 얼음 조각을 넣어서(4℃)2-3분후에 콜로디온 2% 또는포름발 염화 에틸렌 용액을 1-2방을 떨어뜨린다. 주위에 주름이생겨서 중앙부근이 완전히 막을 형성하기 전에 입으로 분다.이때 될수 있는한 입을 가까이 대고 약하게 부는 듯 하게 하면 균일하게 구멍이 생긴다.

4) 2-3분 후에 막이 완전히 형성된다.그것을 확인후 금속대를 들어올려서mesh에 막을 접착한다.

5) 금속대체 부란기안에서 (40-45 ℃)건조

6) 건조후 막이 직접 불에 닿는 듯이 하여 알콜램프로 굽는다.

7)카본보강

B. mesh와 지지막 또는 시료와 접착법

. 염색 및 수세 중의 절편의 떨어짐, 지지막과 절편의 떨어짐 등을 방지하기 위하여 다음의 처리를 행한다. sheet mesh의 표면에 접착성을 처리하는데는 클로로프렌라바(Noeplene W) 0.2-0.5%톨루엔 용액을 만들어, 완전히 세정한 슬라이드 글라스 위에 나열한sheet mesh위에 피펫으로 적하한다. 용제가 휘발한후 mesh의 표면은 접작제층으로 덮여진다.

V 블록의 절삭 (Triming), 글라스나이프의 제조법 및 초박절법

1. 블록의 트리밍

초박절에 앞서서, 블록에 적당한 트리밍을 가해서 시료를 초박절편 할 면을 노출 시킬 필요가있다. 트리밍 할 때 에는 포매의정도 경도 등에 따라서 절삭의 각도를 변화시킨다. 블록의 상태에 응해서트리밍을 하는 것이 좋다. 트리밍에는 안전면도날 (양면,편도) 사용법을 알면 좋다. 박절면의 면적은 얇은 절편을 희망할수록 정도로 작게하지않으면 않되지만 통상 0.5-1.0㎣정도로 하는것이좋다. 박절면의 형태는 가능하면 정방향에 가까운 편이 좋다.

2. 글라스나이프제작법

트리밍한 블록은 글라스나이프를 사용해서 초박절하지만 나이프가 나쁘면 나이프자국이, 흔들림 등의 원인이 되는 일이 많으므로 될 수 있는대로 좋은 나이프를 만들도록 주의한다.

1. 다이아몬드로 그은선이 있는쪽을 위면으로 하여 절단선밑에, 성냥개비,가는철봉 등의 꺽쇠를 넣고, 좌우 같은힘으로 위에서부터 눌러가면 절단선이생기고, 장방향의 글라스판(8-4cm)이 2매가된다. 이때 새로 갈라진면은 한점흠도없는 mirror-surface가 된다. 꺽쇠를 넣어서 손가락으로 눌러 쪼개거나 가장자리가 약간 꾸부러진 글라스 ꥅ치의 중심선에 맞추어 조용히 힘을주어 갈라도 좋다.

2. 책상 가장자리에 가득 글라스를 놓고 손가락은 될수있는한 글라스판의 양하단을 같은 힘으로 눌러서 전단부의 글라스연이 올라올정도로 누르면 .바르게 똑바로 쪼개진다. 만약 도중에서 좌측이나 우측에 할선이 굽어질때응 대부분 누르는 방법의 불균형, 최초의 절단선을 넣는법이 나빴기 때문이다. 이때 사용하는 글라스판은 미리세제로 충분히 씻고, 오염물을 세척하여 놓을 것, 또, 손가락도 청결히해둔다. 상처 등이 없도록충분히 주의하여 취급할 것, 현재에는 다이아몬드 나이프도 사용되게되었다.

3. 다음에 남은 8cm 변의 중앙에 같은 방법으로 틈을 넣어서, 다시한번 mirror-surface를 갖는다.

한변이 4㎝의 정방향을 4개 얻을 수 있다.

4. 하방의 직선사에 mirror-surface를 위의 좌우에 가도록 놓고, 자를 붙이고, 잘 목측하여 글라스 절단기로 대각선을 따라 약간만 좌 또는 우(어느쪽인가 칼날을 만들 때 정한다.)로 기울여서 정점에서 0.5㎝아래로부터 금을낸다.

5. 이것을 이미 서술한 것과 똑같이 하여 글라스에 절단선을 넣어 간다. 두드려서 쪼개버리지 않도록 주의한다. 절단선은 다이아몬드로 만든 자국의 상단부터 조금 나간 곳에서 멈추어서, 꺽쇠를 아래로 넣고 글라스 ꥅ치로 쪼갠다. 혹은 백열한 글라스 봉을 자국 위에누르는 등 하여 열로 쪼개면 좋다. 이렇게 하여 한변 8㎝의 글라스판에서 4개의 글라스 나이프가 이상적으로는 얻게 된다. 그러나 처음동안에는 생각처럼되지않는다. 만들어진 칼날을 다음과 같이해서 조사하고 좋은 칼날을 사용하고 그외에 는 버린다.

7. 이것들의 쪼개는 법으로 좋은 칼날을 얻는 가장 중요한 조건은 한변 4cm의 판글라스로부터 칼을 만들었을 때 칼이 되지 않고 버리는 편의 삼각편의 칼과 대각에 있는 귀퉁이늬 자른 나머지가 귀퉁이에서 1mm 이내에 들어갈 때에는 거의 만점에 가까운 칼날을 얻고, 위부분의 쪼개고 남은 곳이 많을 때 (2-3mm)는 그 경우에 있어서는 불량한 칼이 된다.

8. 만들어진 칼을 40-60배 정도의 실체 혹은 광학현미경 저배율하에서 광선을 잘 가감하면서 정밀조사하고, 작은 "톱날"이 있는지 없는지를 보고, 좋은 칼을 선택한다. 불량한 곳에 표시를 해서 사용하는 사람도 있다.

9. 좋은 칼을 선택하면, 각각의 초마이크로톰에 맞는 크기에 칼의 형태를 준비한다. 글라스 절단기로 자르고 나서 글라스뺀치로 나르면 칼이 완성한다. (LKB의 나이프메이커는 여기까지 기계의 조작으로 가능하다. 三慶의 나이프메이커로는 이부분은 각자가 행한다.)

10. 칼 형태가 잘된 좋은 글라스나이프가 만들어지면 비닐테이프 등으로 칼날에 보트를 단다.

3. 초박절 (Ultra-thin sectioning)

· 초박절 하기전에 블록 표면을 적당히 자른다. 적당히 자르는 것은 초박절에 이용하는 글라스타이프의 일단에서 행한다. 이때에 광학현미경용 절편을 잘라 그 절편을 톨루이딘블루 등으로 염색하여 현미경하에서 목적하는 장소를 정하고 박절에 들어간다.

·초박절편은 Ultra-microtome을 사용하여 얻게되지만, 두꺼운 절편은 전자선이 통과 하기 어려우므로 될 수 있는대로 얇게 만들지 않으면 안된다. 우선 나이프를 ultramicrotome에 set하고, 증류수를 넣고 거기에 박절한 절편을 띄운다. 두께의 판정은, 보-트내에 떠있는 절편은 빛의 간섭현상에 의하여 착색되어 보이므로 그 착색의 정도에 따라서 판정한다.

· 절편의 색조와 두께의 관계

은회색 -60mu

은 60-90mu 사용가능

금 90-150mu 사용가능

자 150-190mu 사용불가

청 190-240mu 사용불가

녹 240-280mu 사용불가

황 280-320mu 사용불가

Ⅵ. 시료를 올려놓기

· 톨루엔으로 0.2%-0.5%로 희석한 mesh세멘트를 mesh에 붙여서 보트내에 떠 있는 절편 위에 핀셋으로 잡고 가볍게 눌게 붙인다. 이때에 보트내의 물을 절편위에 남기지 않는 것이 절편에 먼지드르이 오염을 남기지 않는 요점이다.

Ⅶ. 대조광현절편

1. 톨루이딘불루 염색 (山本, 解剖誌, 39, 124, '63)

ⅰ) 슬라이드에 증류수를 1방울 떨어뜨려 그곳애 1u두께의 절편을 띄운다.

ⅱ) 가열 건조 접착 (끓여서는 안된다. )

ⅲ)염색액을 절편위에 마운트한다. 가온 5분후에 수세, 건조.

염색액 : 1 % 톨루이딘블루 수용액

M /15 인산 buffer sol. pH 7.8-8.0등량 혼합.

2. 염기성 후크신 . 메틸렌 청염색 (村上, 島田, '70)

i) 건조 절편 (1-2u)를 만든다.

ii) 50%알콜에 용해한 1%염기성 후크신으로 2분 염색 (실온)

iii) 증류수로 수세, 건조, 필요하면 70% 알콜로 분변

iv)pH 7.0-8.0 카코딜레이드 완충2% 메틸렌 청으로 2분 염색(실온)

v)수세 건조 봉입 (체델유 (cedar wood oil )또는 에폭시 수지 )

염색성 : 세포질 ------- 담홍색

핵 ------- 담청

적혈구 ------- 심홍

교원섬유 ------- 대연청

탄성섬유 ------- 농자

3. 탈 에폰법 ( IMAI et al., ' 電류치 17, 84)

I)건조 절편 (1-2u)를 탈에폰액에 10-15분 담근다.

탈 에폰액 :KOH 무수알콜 포화액,하루밤 방치 담암 황갈색의 수용액 약28%

ii)무수알콜로 4회 씻는다.

iii)물에 되돌린 다음 H&E, PAS, Gimsaduator등이 가능

Ⅷ. 전자 염색 (Electron staining)

전현으로 형광판에 상이 보이는 것은 시료중에 질량이 무거운 원자에 의하여 전자선의 산란이 생겨 전자빔의 안에 전자농도차가 생기고, 이것이 확대투여되기 때문이다. 일반전자 염색법은 생물시료에 중금속염의 용액을 작용시켜 콘트리스트를 증가시키는 방법이다.

A. 우라늄 염색 (Urany1 staining)

초산 우라늄 (Watson, '58)

50%에탄올 초산 우라늄 포화용액 (15℃에서 7.7%용해)

염색시간 : Epon 초박절편으로 5∼10분

B. 납 염색 (Lead staining)

(1) Lead tartrate (Millonig, '61)

Stock solution : NaOH 12.5g

K-Na-tartrate 5.0g

Dist. water 50.0ml

염색액 : Stock solution 0.5 ml

Dist. water 100.0 ml

수신화납(Ph

{ (OH)}_{2 }

) 1.0g

가열하여, 냉각 후 여과, 액은 투명하게 된다. pH 12.3

염색시간 : Epon 초박절편 ---- 5 ∼ 20분

(2) Lead citrate (Reynold. '63)

A액 : Lead citrate 1.33g

Sodium citrate 1.76g

Dist. water 30.00ml

(혼합하면 백색의 suspension이 된다. 30분 방치)

염색액 : A액 30ml

IN-NaOH 8ml

증류수를 가해서 50ml되게한다, pH 12

염색시간 : Epon 초박절편 -------15∼20분

폴리에틸렌병, 냉암소에서 6개월간 안정

(3) Lead citrate (Venable &Coggeshall, '65)

A액 : Lead citrate 0.01 -0,04g

Dist. water 10.0ml

염색액 : A액

10N NaOH 0.1ml

(밀폐하여 보존하면 수개월간 사용가능)

염색시간 : 에폭시 절편 ------- 10초∼5분

(4) Lead acetate : 블록 염색법 (천 '66)

염색액 : Lead acetate(초산납)의 무수알콜 포화액

무수아세톤

동량혼합, 10분간 교반, 여과하여 사용한다.

방법 : ⅰ) 100% 알콜 탈수시 2시간 블록염색

ⅱ) 알콜 + 아세톤 (1:1)액으로 2회 씻는다.(각 10-20분)

ⅲ) 이하 통상의 포매조작으로 옮긴다.


(5) Sato 법

lead nitrate 1g

lead citrate 1g

lead acetate 1g

Sodium citrate 2g

DW 82ml

4% NaOH 18ml

Ⅸ. 전자염색의 실제

1) 초산우라늄액 10분염색

2) 50% ETOH 2-3회 수세, 건조

3) 납액으로 10분염색

4) 증류수(끓인 후 냉각)로 2-3회 수세, 건조하여 관찰한다.

주사형 전현용 시료 작제법

1. 일반적 관찰 표면의 점액등을 제거한다.

① 세정 관찰 표변의 점액등을 제거한다.

1) 생리적 색염수 세척

2) 효소처리

3) 용매, 초음파 세정들을 목적으로 해서 선택 사용한다.

② 고정 투과형전현 시료 작제시에 사용한 것을 사용한다.

(예) A. 생체조직

1) 2.5 - 3.0% 글루타르알데히드 및 1 - 2% 오스뮴산 이중고정 (인산 buffer 또는 카고지 레이트 buffer)

2) 2.5 - 3.0% 글루타르알데히드 단독고정

B. 효모 (다당류를 많이 함유한다.)

2.5 - 3.0% 글루타르알데히드 → 1% 과망간산 칼륨후고정(인산buffer)

C. 세균류

1) 2.5 -3.5% 글루타르 알데히드 단고정

2) 또한 1 - 2% 오스뮴산 후고정 (인산buffer)

D. 곰팡이류, 포자를 갖고 있는 것 오스뮴산의 증기고정

③ 탈수 1)알콜

2) 아세톤

3) 아밀아세테이트를 사용한다.

④ 건조 1) 100% 알콜, 아세톤으로 탈수 후 자연건조, 또는 진공건조

2) 100% 알콜→아세테이트 → 자연건조

⑤증착 1) 요철이 많은시료 : 카본 + 이중증착

2) 요철이 적은 시료 : 금증착

기타 금, 파라디움(palladium)합금, 백금 카본, 백금 파라디움 합금도 사용가능

ⓞ 작제법의 일례(5㎟ 정도의 조직편의 경우)

고정 : 2% 글루타르알데히드 2시간 (0-4℃)

세정 (인산 buffer 로) 20분 3회 ( " )

1% 오스뮴산 (MILLONIG) 1시간 ( " )

탈수 : 50% 알콜 (또는 아세톤 )

70% " "

80% " "

90% " "

100%-Ⅰ " "

100%-Ⅱ " "

건조 : (여지위에서 자연건조) 적당

(시료내부를 관찰하는 경우는 알콜내 또는 건조후 면도칼로 절단한다.)

증착 : 카본 2분 시료의 요철 등에 따라 다양

금 1분

('72)는

① 1% 오스뮴산 고정 → 알콜 →공기건조

② 3% 글루타민알데히드 +오스뮴산 고정 → 알콜 → 공기건조

③ 4% 포르말린 + 오스뮴산 → 알콜 → 공기건조

이상의 3개를 조합한 것이 소장 융모의 관찰에 좋은 결과를 얻었다고한다.







시료

세정

고정(글루타르알데히드 오스뮴산등)

↓ ↓

탈수 (알콜, 아세톤 , 아밀아세테이드등) 동결

건조 파단면

↓ 동결 동결

증착 파단면 직접

↓ 직접관찰 관찰

관찰

건조 1. 공기중 건조법

2. 동결 건조법

3. 임계점 건조법

Ⅱ 특수한염색

1. 임계점 건조법 (Critical point dry)

미융모, 선모 등의 건조시의 변형제법

2. 동결직접 관찰법(Freeze and direct observation: 1,000배이하)

2' . 동결건조법 (Freeze dry)- 건조시 변형제법

3. 동결은 파단면 작제법 (Freeze fracture method)

3'. 수지 할단면법 (Resin cracking method)

4. 탈 수지법 (Resin removing method )

3,3',4는 각 세포의 할단면의 관찰에 사용된다.


촬영후 전자현미경 필름의 처리

Ⅰ. 현상

통상, 코피날 (FUJI:D-72)액을 갖추고, 농도를 묽게하거나 현상시간을 바꿈으로써 대부분의 재료에 대해서 사용할 수 있다. 그러나 암부와 명부의 차(contrast)가 대단히 크고, 그 사이의 밝기의 단계가 있는 것은, 마이크로파인 (초미립자용 조합제)나 D-76(미립자용)을 사용하여 비교적 soft한 네가 필름을 얻도록 노력한다. soft한 네가 필름으로부터 hard 한포지필름을 얻는 것이 용이하다.

현상액 처방

약품



D-72(g)

D-11(g

D-178(g)

메톨


3

1

_

무수아황산소다


45

75

90

하이드로퀴드


12

9

45

탄산소다


80

34


가성소다


-

-

18

Potasium

bromide


2

5

30

물을가한전량


1L

1L

1L

현상온도


20℃

20℃

20℃

농도를 묽게하는법

(a)

그대로

그대로

그대로

(원액):(물)

(원액):(물)

(b)

(c)

1:1

1:2

-

-

-

-


Ⅲ 시료의 콘트라스트

. 콘트라스트가 큰 시료에는 미크로파인

. 콘트라스트가 작은 시료에는 D-178로 70-100초

.네가 현상은 D-72 (1:1) 20℃ 4분, 인화지는 F3가 표준이다.

. D-72는 시판 조합제 콜렉톨로도 비슷한 특성을 주는 것이 가능하다.

정지 1.5% 초산 수용액에 수 분 담근다.

정착 감광성 할로겐은을 하이포(티오 황산나트륨)로 녹여가는 것이 정착처리이다.

인화지의 현상이 끝난 것은 반드시 정착액에 담그기 전에 1.%빙초산액에 현상정지를 행한다.

빠른 정착을 필요로 한다면 정착제에 염화암모늄50g/1을 가하면 1/2-1/3의 시간에 끝난다.

정착액의 일례

A액 :물 600㎖

티오황산나트륨 300g

B액 :물 200㎖

무수 아황산나트륨 15g

빙초산 12㎖

나복스 12g

칼슘알룸 20g

A,B 두 용액을 다른용기에 용해한다.A액을 교반 하면서 천천히 B액을 가한다. 물을 물을 가해서 전량을 1L로 한다. 인화지용정착액으로는 상기 처방으로부터 경막제의 알룸을 제거해도 좋지만,

여름에만 5g/1를 넣는 편이 안전하다.이외에 여러 가지 종류의 조합제 (Fuji Fix, Fuji super Fix)가 시판 되고 있다.

Ⅲ전자현미경 슬라니드 제작법

A. 직접법 (전현 네가필름으로부터 직접 반전하는 방법)

장점: 간편하고 조속히 제작 가능

1. 노출, 현상:

1) 암실내에서 네가필름을 인신기 (확대기)에 걸치고, 전현슬라이드용 마운트의 외면적 (40X40mm)에 맞추어서 축소상이 나오도록 조절한다.(extention tube사용)

2) 미사용 전현 필름을 4분절하녀 감광막면위 (암실 적색등 아래서 회백색을 나타낸다.)에서 단시간 노출(1-2초정도, 포커스에 주의한다.)

3) 노출면을 아래로하여 현생액증에 투입하여 현상한다.

현상액 : 코렉톨 인화지용 현상액을 다시 물에 2뱁 희석한 것.(희석도를 바꿈에 따라서 슬라이드의 연경조도를 바꿀 수 있다)

비노출면에 상이 살짝 나타난 시점에서 조속히 정지액증에 옮긴다.( 현상시간 1분이내, 단시간에 검게된때에는 노출과다이므로 안된다.)

2. 정지 : 정지액 (1.5%초산수용액)중에 1분 이상.

3. 정착 : 정착액에 30초 이상

정착처리에 의해 미노출부 감광막이 소실되고, 필름에 투명감이 생긴다. (이때 느리게 정착액을 교반하여 슬라이드 필름 여러개가 밀착하여 정착부족에 빠지는 것을 방지한다. 상처 내지않도록 주의)

4. 수세 : 흐르는 물에 1시간 이상

5. 건조 : 드라이 웨액에 담근 후, 집게로 찝어서 건조시킨다.

6. 적절한 크기로 트리밍하여 상술 전현 슬라이드 마운트 내에서 마운트한다.

B. 간접법 (확대한 사진에서 복사, 반전하는 방법)

장점 : 화면내에 지시기호나 배율 스케일 등을 기입하는 것이 가능.

1. 전현 네가 필름으로 6절대사진을 만들고, 켄트지 등의 대지에 붙인다.

2. 필요에 따라서 인스턴트 레터링 등을 사용해서 화ꅱ내에 지시기호등을 넣는다.

(핵:N,분비과립Sg등)

3. 초미립자필름 (네오판 F)등에 복사 (35mm, 브로니판)하여 네가필름을 얻는다.

4. 미사용 전현 필름에 반전하여 전현슬라이드를 만든다.(이하 직접법에 준한다.)

3.초박절(Ultra-thin sectioning)

. 초박절 하기전에 블록표면을 적당히 자른다. 적당히 자르는 것은 초박절에 이용하는 글라스나이프의 일단에서 행한다. 이때에 광학현미경용 절편을 잘라 그 절편을 톨루아딘블루 등으로 염색하여 현미격하에서 목적하는 장소를 정하고 박절에 들어간다.

초박절편은 (Uitra-microtome)을 사용하여 얻게 되지만, 두꺼운 절편은 전자선이 통과하기 어려우므로 될 수 있는데로 얇게 만들지 않으면 안된다. 우선 나이프를 uitramicrotome에 set하고, 증류수를 넣고 거기에 박절한 절편을 띄운다. 두께의 판정은, 보-트내에 떠있는 절편은 빛의 간섭현상에 의하여 착색되어 보이므로 그착색의 정도에 따라서 판정한다.

절편의 색조와 두께의 관계

은회색


-60mu




60-90mu

사용가능



90-150mu

사용가능



150-190mu

사용불가



190-240mu

사용불가



240-280mu

사용불가



280-320mu

사용불가











8. 만들어진 칼을 40- 60배 정도의 실체 혹은 광학 현미경 저배율하에서 광선을 잘 가감하면서 정밀조사하고, 작은 "톱날"이 있는지 없는지를 보고 , 좋은 칼을 선택한다. 불량한 곳을 표시해서 사용하는 사람도 있다.

9. 좋은 칼을 선택하면, 초마이크로톰에 맞는 크기에 칼의 형태를 준비한다. 글라스 절단기로 자르고나서 글라스 ꥅ치로 자르면 칼리 완성된다. (LKB의 나이프메이커는 여기까지 기계조작이 가능하다.三()의 나이프메이커로는 이부분은 각자가 행한다.)

10. 칼의 형태가 잘된 좋은 글라스 나이프가 만들어지면 비닐테이프 등으로 칼날에 보트를 단다.