환경오염물질 탐색용 형질전환 zebrafish 제작

실험실에서는 사람의 1) 가지 공해물질 반응 유전자 promoter 클로닝하여 2) 이를 형광 단백질을 발현하는 벡터에 삽입하고, 3)개발된 염기서열을 결정하여 벡터 구조를 확인하고 4) 형질전환 Zebrafish 번식system 구축하고 있다. 공해물질 반응 유전자 promoter 클로닝하여 이를 형광단백질을 발현할 있는 벡터에 삽입하기 위해 형질전환 zebrafish 개발하고 있다.

 

공해물질 반응 유전자 promoter 살펴보면 heat shock protein responsive element (HSRE), p53-responsive element (p53RE), AhR-responsive element (AhRE), electrophile responsive element (ERE)이다. 이들을 각각 클로닝하여 형광단백질을 가진 벡터에 삽입하는 것이다. 각각의 벡터에 삽입할 promter 대한 내용을 보면 다음과 같다.  

HSRE 70 kDa heat shock protein 발현을 조절하는 element로서, HSP70 다양한 화학적 이나 물리적 자극 조건에서 발현되어 세포내에서 스트레스에 의한 손상을 최소화하고, 새로 합성된 단백질의 정상적인 folding 관여하는 세포질 단백질이다.  cadmium 등에 의하여 세포내의 단백질의 변성 등의 손상이 있을 시에 cis-acting promoter elements HSRE 작용에 의하여 HSP70 유기 발현된다.  HSRE 얻기 위하여 사람의 간암 세포인 HepG2세포를 배양하여 DNA 추출하였다. 그리고 사람의 heat shock protein specific primer 사용하여 PCR기법으로 사람의 간암세포인 HepG2 genomic DNA 내의 Hsp70 유전자의 5'-promoter region 다량 증폭하여 이를 pCR3.1 벡터에 클로닝하였고,  벡터의 염기 서열의 결정하여 기존에 발표된 Hsp70 promoter 염기서열이 일치함을 확인하였다.  240bp promoter region에는 3개의 HSRE 포함하고, CAAT inverted TATA box 등의 요소를 포함하고있기때문에, 환경 물질등의 Hsp70 활성화시키는 요소에 노출시 효율적으로 활성화 것으로 예상된다.  Hsp70 promote 바로 pEGPF 벡터에 바로 삽입하기에는 어려운 관계로 pGEM-T 벡터에 삽입하였다. pEGFP-N1 벡터와 동일한 Restriction enzyme처리가 가능한 pBluescriptII(+) 다시 삽입하여 염기서열을 분석하여 Hsp70 형태가 유지되고 있는 것을 확인하였다. pBluescriptII(+) 벡터에는 Restriction enzyme 처리할수 있는 위치를 제작하여 삽입하였다. 그후 Restriction enzyme 처리하여 위치에 Hsp70 promoter 삽입한 것이다. 확인한후에 이를 Clontech사에서 판매하는 pEGFP-C1 벡터의 CMV 제거하고 위치에 pBluescriptII(+)벡터에 삽입되어있는 Hsp70 제거된 CMV 위치에 삽입하여,  pHSRE-EGFP 완성하였다.

 

p53 responsive element 관하여서는 50bp oligonucleotide 구성된 promoter 설계 제작하였다. 염기서열은 TTA TAG AAC ATG TCC CAA CAT GTT GAG AGG GTA TAT AAT GAG CTA GCG CTG CCG AGC TGG TTT AGT GAA CCG TCA GA이다. 염기서열에는 p53RE TATA box 포함하여 유전적 독성이 있는 환경물질 등에 노출되었을시 활성화 있도록 설계하여 합성하였다.  p53 단백질은 전사요소로서 세포의 cell cycle G1 phase에서 S phase로의  진행의 조절에 관여하여, 세포내의 유전물질의 손상을 복구하기 위한 시간을 주는 등의 중요한 단백질이다.  단백질은 사람의 다양한 장기의 조직에서 빈번히 돌연변이 되어 발견되어 발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있다.  억제유전자로서 알려진 단백질이 세포내의 유전물질의 손상에 의하여 발현되므로, 이를 토대로 환경물질의 탐지에 이용하는 것이다.  p53 유전자의 5' region 존재하는 p53RE 세포내에서 비특이적인 발현을 최소화하기 위하여 E1b minimal promoter 연결하여 사용하였다.  p53RE 포함하는 promoter 제작은 합성된 서로 상보적인 oligonucleotide 결합였다. 이렇게 만들어진 pormoter 양끝은 AseI/NheI restriction enzyme site 가지고 있기 때문에 삽입하고자 한는 pECFP-C1벡터의 AseI/NheI 의해 제거된 위치에 삽입이 가능하였다. 삽입하고자 하는 위치는 pECFP-C1 CMV region으로, 위치에 제작된 pormoter 삽입하면 우리가 원하는 발현이 나타날 이라고 생각한다. 삽입이 벡터는 클로닝을 하여 우리가 삽입시킨 promoter 확보하였다. 그리고 pormoter 올바른 형태로 삽입이 되었는지를 확인하기위하여 염기서열분석을 하여 원하는 벡터를 확보하였다. 위의 방법을 통하여 얻은 p53RE-ECFP zebrafish cell(ZEM2) 적용하기 전에 사람과 마우스의 세포에 적용하는 단계에 있다.

 

Aromatic hydrocarbon responsive element (AhRE) 사람 간암세포인 HepG2 cell genomic DNA에서 AhR specific primer 사용하여 PCR 기법을 사용하여 증폭한 이를 클로닝하는 중이다.  1250 bp PCR product 내에는 7 이상의 AhRE element (5'-CACGC-3') 포함하여 zebrafish 내의 Aromatic hydrocarbon receptor (AhR) 해당하는 단백질과 결합할 것으로 생각되는 , TATA box 포함하여 polycyclic aromatic hydrocarbon, dioxin 등의 환경 물질 등에 특이적으로 반응하도록 설계하였다.  AhR 사람 세포에서 dioxin 등의 화합물과 결합하여 세포질에서 활성화되어 핵으로 이동하여, 여러 대사 관련 유전자의 5' region 있는 AhRE 결합하고 해당 유전자를 발현하는 것으로 알려져 있다.  AhR 의하여 발현되는 일련의 유전자를 소위 AhR battery라고 하고 이에는 Cyp1A1 등이 포함된다.  연구에서는 CYP1A1유전자를 PCR 기법으로 다량 확보하여 이를 pGEM-T vector 삽입하였다.  pGEM-T 벡터는 삽입된 product 염기서열을 분석하여 다음 과정에 이용하였다. 직접적으로 pEGFP 벡터에 삽입하지 않는 이유는 PCR product pEGFP 벡터 바로 삽입하는 것에 어려움이 있어서 다른 pGEM vector 삽입한후 pEGFP-N1 벡터와 공통된 Restriction enzyme 처리하여 삽입하였다. 삽입위치는  5' region CMV 제거하고 pGEM에서 얻은 AhRE 삽입하여 이를 클로닝하여pAhRE-EGFP 완성하였다. 완성된 벡터는  2차년도에는 벡터를 가지고 있는 세포를 제작하여 polycyclic aromatic hydrocarbon등에 노출하여 EGFP 발현성과 농도-반응성을 관찰할 예정이다.

 

Electrophile responsive element (ERE) pDsRED1 삽입, 클로닝하여 zebrafish cell 적용하거나, transgenic zebrafish 제작에 사용될 예정이다.  ERE 포함하는 oligonucleotide promoter 합성하여 DsRed1 형광을 발하는 벡터와 연결하는 , ERE promoter 염기서열은 TAA TTA ATA AGC TTG GAA ATG ACA TTG CTA ATC GTG ACA AAG CAA CTT TGC TCA GGG TAT ATA ATG ATC ATG GCT AGC A 이다.  promoter E1B minimal promoter 포함하여 비특이적 발현을 최소화하도록 설계하였다.  ERE 세포에 존재하는 산화적 스트레스에 반응하여 활성화되는데, 세포내의 활성산소, 각종 radical, 외부물질의 대사산물 등이 산화적 스트레스를 유발하는 것으로 관찰된다. 활성산소는 내인적으로 항상 발생하기도 하는 , 세포내 호흡과정에서 미토콘드리아 내의 산소는 전자에 의하여 환원되어 H2O 대사되는 , 과정에서 산소분자가 하나의 전자를 가진 상태는 superoxide anion으로 세포내의 대표적인 산화적 스트레스 물질이다.  우리가 폐호흡을 통하여 흡입하는 산소의 2-5% superoxide anion 상태가 되는 것으로 알려져 있다.   연구에서는 산화적 스트레스에 반응하는 ERE 요소를 DsRed1 연결하기 위하여 ARE 확보하기위하여 서로 상보인 형태의 oligonucleotide 제작하였다. 제작된 oligoucleotide 서로 결합할 있는 형태로 제작하였기 때문에 서로 반응을 시킴으로서 얻을수있었다. 이렇게 만들어진 pormoter 양끝은 AseI/SacII restriction enzyme site 가지고 있기 때문에 삽입하고자 한는 pDsRed1-N1벡터의 AseI/SacII 의해 제거된 위치에 삽입이 가능하였다. 삽입하고자 하는 위치는 pDsRed1-N1 CMV region으로, 위치에 제작된 pormoter 삽입하면 우리가 원하는 발현이 나타날것이라고 생각한다. 삽입이 벡터는 클로닝을 하여 우리가 삽입시킨 promoter 확보하였다. 그리고 역시 우리가 삽입한 promoter 형태가 올바른지를 확인하기 위하여 염기서열 분석을 하여 올바른 형태의 벡터를 확보하였다. 이러한 방법으로 pERE-DsRed1 벡터를 제작하고, 이를 zebrafish세포(ZEM2 cell) 적용하여 산화적 스트레스 물질에 노출과 DsRed1 유전자의 농도 반응성을 연구하고 이를 토대로 벡터를 포함하는 형질전환 transgenic zebrafish 제작할 예정이다.

 

각각의 벡터를 제작하는 과정중 클로닝의 과정은 BioRad사의 Micropulse 사용하였다. Transformation 하고 colony 선별할 있는 배지에서 키워서 나타난 colony 배양하여 이를 Qiagen사의 miniprep kit 사용하여 세포(TOP10) 안에 있는 plasmid DNA 추출하였다. 추출한 plasmid DNA 염기서열 분석을 통하여 우리가 삽입하고자 하는 promoter 확인한 것이다. 염기서열 분석과정에서 우리가 삽입한 promoter 위치가 바뀌는 형태도 나타나고 하였는데 이는 환경오염물질에서 반응이 나타나는 것이 아니기 때문에 모두 폐기하였다.

   1년차 연구의 핵심인 벡터 젝작에 관한 사항들을 총괄적으로 요약하면 환경오염물질에서 반응을 하는 promoter들은 heat shock protein responsive element (HSRE), p53-responsive element (p53RE), AhR-responsive element (AhRE), electrophile responsive element (ERE) 등이 있다. 우리는 각각의 promoter 형광단백질을 발현하는 벡터에 삽입하는 연구를 하였다. 벡터의 제작과정은 위에 설명하였다. 이렇게 제작된 4가지 벡터는 다양한 환경물질의 영향에 의한 세포 내의 작용에 따라 반응하도록 설계하였다.  그러므로 벡터로 만들어진 transgenic zebrafish 그에 따라 체내에서 형광 단백질을 발현할 것이다.  이러한 방법으로 오염된 물에 존재하는 다양한 물질을 세포내의 작용에 따라 탐지할 있다.  연구에 의한 분석방법은 기존의 분석 장비를 이용한 기법보다 빠른 시간 내에 저비용으로 그리고 생물학적 작용을 고려한 탐지를 가능하게 하므로 활용성이 높다고 하겠다. 

   제작한 벡터의 세포에의 적용를 시작하여 zebrafish 세포(ZEM2 cell) 주문하였고 이에 앞서 마우스 간세포인 Hepa1c1c7세포와 사람의 간세포인 HepG2세포에서 발현을 확인하고 있다. 과정에서 우리가 목표하는 바가 확인되면 ZEM2 cell에서 적용할 것이다. 

   지금 까지 벡터 제작에 관해서는 당해연도의 연구 목표에 준하여 연구가 진행중이며, 계획된 바와 같이 1년차연구결과물인 4가지 벡터를 이용하여 zebrafish 세포에 적용하는 실험을 진행할 있도록 준비 중이다. 준비과정으로서 마우스와 사람의 세포에서의 벡터들의 발현을 확인하는 단계로서 제작된 벡터를 사람과 마우스의 세포에 transfection 시켜서 벡터들이 발현하는 환경을 만들어 우리가 제작한 벡터의 사용이 가능한 것을 증명할 것이다. 제작되 벡터의 사용이 가능하다는 것이 확인되면 본연구과제의 실질적인 목표인 transgenic zebrafish 제작에 응용할 있도록 세부과제에 공여되어 transgenic zebrafish제작에 이용될 있을 것이다. 연구는 당초 계획되었던 데로 진행 중이고, 계속적인 문헌조사를 통하여 최근의 관련 기술동향을 파악하여 개선된 기술이 보고되면 연구에 반영할 계획이다.

 

  또한 zebara fish 사육조건을 확립하였다. 역삼투압 정수기로 물을 정수시킨 1 정도 미리 물을 받은 수조에 연결한다. 여기에 스폰지 여과기로 간단히 여과과정을 거쳐 연속적으로 수조의 물을 교체해야하는 번거로움을 줄였다.

 

 그림 1. 실험실 자동 순환식 어항 시스템 확립

 

Embryo Embryo water methylene blue 그리고 Ringer's solution에서 5일가량 키운후 수조에 넣어준다 (Embryo water; 0.2 g/ l of sea salt, Methylene blue; 500 ml embryo water + 50 ul methylene blue, Ringer's solution; 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.2). Embryos removed from their chorions이면 calcium 필요하고 embryo medium  에서 유지하여야 한다. 1 1-2 급이( 1 공급시 5분이내에 먹을수 있는 양만을 공급)하며 식이는 dry or moist trout pellet 또는 dry flake food like Tetra bland 주며 새우를 부화시켜 주면 영양가 먹이로 훨씬 영양상태에 도움이 되었다 (brine shrimp eggs, JAQNO).

Brine shrimp eggs 부화 조건: 식수 1l, NaCl 20 g, 10N NaOH 130 ul, 새우알 4 스푼을 포함하여 28℃롤 24시간 정도 부화하면 DW washing하여 zebrafish 급이시킨다. 온도는 28℃를 유지하며 10 dark /14 light 빛을 조절하였다.

Breeding( Method for maximal embryo production ) 우선 mating 하기 전날 암수를 분리하였던 상태에서 합사하였다. 암수 3마리 합사한 마찬가지로 저녁 10시면 dark 만든다. ; 대량의 수확 (1000/tank) 1 or 1/2

   ·암수를 각각 분리하여 사육, female 8 또는 male 16 / 10 gallon tank

   ·하루 2-3 사료 급이하였다.

   ·embryo 필요한 전날, 조명 1-2시간 전에 사료 투여하고 탱크 청소

   ·그 다음 male female 있는 tank 1 male : 1 female 비율로 합사

    ( 3 male : 3 female 가장 좋았다 )

   ·다음날 조명이 시작한 zebara fish 빛을 받으면 발정을 일으켜 10 이내에 방란하였다.

 

 

그림 2. Brine shrimp eggs 부화 조건 확립                                     그림 3. Zebrafish mating              

 

Egg collection

   ·철망의 mesh embryo eggs 통과하여 zebrafish eggs 먹지 못하게 2시간정도 놓아두어 끝까지 수정란을 얻기 위한 노력을 한다.

   ·embryos mold 생기는 것을 방지하기 위해 신선한 10% Hank's            saline으로 세척 또는 0.5% bleach sol 2 소독하였다.

 

                그림 4. Egg collection                                                   그림 5.  5일경과 zebrafish babies.

Raising babies

  · embryo petridish에서 물을 매일 갈아주면서 기른다(25-50 embryo/100ml) 35mm   

  · 온도 28.5

  · 수정후 3일만에 부화하지만 4일까지 먹이를 주지 않는다.

  · 그후 플랑크톤과 사료를 갈아서 먹이로 준다.

  · 9일째 사료를 바꾼다. - brine shrimp

  · 매일 물의 1/3 갈아준다.

  · 21일째 tank 옮기고 성체용 사료 급여하였다.

 

 

그림 6. GFP 발현 zebrafish 확립 (CS2+vector)

 

위의 그림 6 같이 zebrafish GFP DNA injection 하여 발현하는 양상을 확인하고 클로닝한 환경오염물질 탐색용 벡터를 주입하고 있다.