MHV specific primers를 이용하여 RT-PCR을 수행한다. 시험법은 하기와 같다.

 1) 진단 대상동물의 간 일부는 채취하여 TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA.)를 이용하여 RNA를 추출한다. 채취한 간 조직을 TRIzol이 500ul 들어있는tube에 담고 homogenizer를 이용하여 균질하게 간다. 이것을 상온에서 5분 방치한 후 200ul의 chloroform을 첨가하고 vortex mix한 다음 4℃에서 12,000rpm으로 20min간 원심분리하여 상층액을 수거하여 0.5ml의 isopropanol과 혼합하여 침전시킨다. -20도씨에서 2시간 침전시킨 후 4℃에서 12,000rpm으로 15분간 원심분리하여 형성된 RNA pellet을 75% 알콜로 washing한 후 DEPC DW에 녹인다.


 2) 분리한 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고 이것으로 MHV specific PCR을 수행한다. cDNA는 분리한 1ug의 RNA를 GeneAmp RNA PCR Core kit(Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)로 합성한다. 합성된 cDNA로 MHV특이적인 nested PCR를 수행하는데 이에 이용된 primers는 표 1과 같고 PCR 조건은 첫 번째 PCR은 94℃ 3min동안 denaturation시키고 94℃ 1min, 55℃ 1min, 72℃ 2min을 30cycle 수행한다. 마지막으로 72℃ 5min동안 final extension한다. 두번째 PCR은 94℃ 3min동안 denaturation시키고 94℃ 1min, 55℃ 1min, 72℃ 30sec을 30cycle 수행한다. 마지막으로 72℃ 5min동안 final extension한다.


표 1. MHV specific PCR primers

Primer

Sequence

1st Forward

5`-AAG CAG ACT GCA ACT ACT CA-3`

1st Reverse

5`-ACA AGA GCA GCA ATT TCT TC-3`

2nd Forward

5`-AAG CAG ACT GCA ACT ACT CA-3`

2nd Reverse

5`-ACA AGA GCA GCA ATT TCT TC-3`