M. pulmonis의 species-specific primer를 이용하여 PCR법을 수행한다. 위에서 분리된 각각의 분리 균주들을 PPLO broth에 넣고 37℃ 혐기 상태에서 5일간 배양한다. 배양한 균은 14,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 pellet down 하였고, 각각의 tube에 500ul의 SNET (NaCl 400mM, EDTA 5mM, Tris-Cl 20mM, SDS 10%) solution (lysis buffer)을 첨가한다. 3 ml 주사기를 이용하여 up and down 하여 cell을 lysis 시킨 후 10 ul의 proteinase K (20mg/ml)를 각 tube에 넣고 vortex mix한 후 56℃에서 overnight 반응킨다. Phenol-chlorofom-isoamyl alcohol이 25:24:1로 섞인 PCI solution (Sigma, USA)을 첨가하고 vortex mix한 후 12,000rpm에서 10분간 원심 분리한다. 상층액을 채취하여 새로운 1.5 ml microtubes에 담은 후 3M sodium acetate buffered solution 50 ul와 800 ul의 isopropanol를 첨가하고 4시간동안 4℃에서 반응시킨다. 12,000rpm으로 원심분리 한 후 상층액은 버리고 DNA pellet은 냉장 보관된 70% ethanol로 2회 washing 한 후 건조시킨다. 멸균 DW를 첨가하여 분리된 DNA을 용해시키고 260nm의 파장으로 흡광도를 측정하여 정량한다. PCR primer는 16S ribosomal RNA의 Mycoplasma species-specific sequence에서 선정하고 (Table 2), PCR mixture는 각 DNA samples 2 μg과 각 primer 100 pmol, 1×PCR buffer, 2.5 U Taq polymerase, 200 μM deoxyribonucleoside triphosphates (PCR Core Kit, Boehringer mannheim, Germany)를 섞어 총 100 μl의 volume이 되게 한다. PCR은 95℃에서 5분을 1 cycle로, 95℃에서 30초, 50℃에서 30초, 70℃에서 90초를 30 cycle로 하고 마지막으로 70℃에서 10분을 1 cycle (Gene CyclerTM, Bio-Rad, USA)로 반응시키고 반응물을 1.5% agarose gel에서 전기영동 (Power PAC 300, Bio-Rad, USA)하여 PCR product band를 관찰한다. Molecular weight marker를 사용하여 band의 크기를 관찰한다.



Mycoplasma pulmonis specific-primer

Primer

Sequence

Product size (bp)

Forward

5`-AAC AGC AGC TGA TAA TCA AA-3`

245

Reverse

5`-CTG AAA GTT TTG AAG AGT TT-3`



Mycoplasma species-specific primer

Primer

Sequence

Product size (bp)

M. pulmonis

  F: 5`-AGC GTT TGC TTC ACT TTG AA-3`

  R: 5`-GGG CAT TTC CTC CCT AAG CT-3`

266

M. arthritidis

  F: 5`-CCT CAA AGC TCC ACT AGA GG-3`

  R: 5`-AGC ATT TCC TCA ACT AAG TG-3`

265

M. neurolyticum

  F: 5`-GAA GCA TAA GAG GTA ACT CC-3`

  R: 5`-GTC ATT TCC TAC CCT ATT TT-3`

278