분리한 각각의 M. pulmonis를 각각 PPLO Broth에서 증식시킨 후 10,000 rpm으로 원심 분리하여 상층액은 버리고 남은 pellet을 0.05% 완충 포르말린으로 부유시켜 24시간동안 불활화 하였다. 불활화 한 각각의 M. pulmonis를 PBS로 10,000rpm으로 2회 원심분리로 세척한다. 불활화한 각각의 항원에 2% SDS를 첨가하여 10분간 boiling 한 후 β-mercaptoethanol이 첨가된 sample buffer와 1:1로 섞어 다시 10분간 boiling 한다.

 

3) SDS-PAGE 및 Western blot

  12% polyacrylamide gels의 각 well에 5 μg씩 항원을 loading하여 200 V로 전기영동한 후, nitrocellulose membrane에 100 V로 1시간 transfer한다. 이후 nitrocellulose membrane을 5% skim milk로 4℃에서 2시간 blocking 하고 0.05% tween 20이 첨가된 PBS로 5분간 3회 세척한 후 자연 감염된 마우스 혈청을 1:40으로 희석하여 실온에서 2시간 반응킨다. 이후 Peroxidase conjugated anti mouse IgG에 2시간 실온에서 반응한 후, DAB kit로 발색하여 공통적으로 나타는 band를 확인하고 공통항원을 탐색한다.


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(lane1: M-1, lane2: M-2, lane3: R-1, lane4: R-2, lane5: M. arthritidis)