성숙한 일반 마우스에서는 임상소견 및 현미경적 소견으로 센다이바이러스 폐렴의 진단이 가능하며, 대개 임상질병과 동시에 일어나는 항체전환으로 확인할 수 있다. HA, HI, RT-PCR, IFA, ELISA등의 혈청학적 진단이 동물의 센다이바이러스 감염 여부를 확인할 수 있으며, Chicken egg allantoic fluid에 접종하거나 MK cell등에 접종하여 바이러스를 배양증식 후 분리할 수 있다.


1. 바이러스의 배양증식

 표준 바이러스로서 American Type of Culture Collection VR-105 (ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 SeV(VR-105)를 구입하여 10일령 SPF 수정란의 (KBNP Inc., San-Bon, Gyeonggi-do, Korea) 장뇨막강 내에 접종 한다 (그림 1). 2 CEID 의 SeV 를 각 계란에 접종하며, 그 방법은 다음과 같다.

        

그림 1. SPF 수정란에 대한 바이러스 접종 모식도.

(1) 수정 1일령 SPF 계란 입수, 10일간 부란기 (온도 37ºC, 습도 100%)에서  흔들어주면서 유지한다.

(2) 10일령에 검란을 하여 천공할 위치를 선정하여 표시하고 알콜과 포비돈으로 SPF란의 난각표면을 소독한다.    

(3) 그림 1에서와 같이 기실부 난각에 구멍을 뚫고, 그 후 바이러스를 접종할 부위의 난각에 구멍을 뚫는다.

(4) SPF란의 allantoic fluid에 2 CEID 바이러스 액(200ul)을 1ml주사기를 이용하여 무균적으로 접종 한다. 이 때 혈관 및 태자가 상하지 않도록 조심한다.

(5) 천공할 때와 반대 순서로, 바이러스 주입구부터 파라핀으로 밀봉을 하고 기실 상부난각의 구멍을 밀봉한다.

(6) 부란기 (온도 37ºC, 습도 100%) 에서 48~72 시간 동안 흔들지 않고 배양한다.

(7) 24시간 간격으로 검란하여 태자가 사망하였을 시에는 즉시 장뇨막강액을 수거하여 바이러스의 농도를 측정한다 (HA titer측정).

(8) 부란기에서 72시간 배양 후 4ºC에서 2~24시간 동안 chilling 한다.

(9) SPF란의 난각표면을 알콜과 포비돈을 이용하여 소독한 후, 둔탁한 기구를 이용하여 기실부의 난각을 제거하고, 무균적으로 난각막을 젖힌다.

(10) 10 ml 주사기를 이용하여, 바이러스가 배양된 장뇨막강액을 수거한다.

(11) 각 SPF란에서 수거된 장뇨막강액은 각각 15ml tube에 나누어 수거하고, 3000rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 수거한다.

(12) 상기과정을 통해 얻어진 상층액을 각종 진단방법에 대한 시료 및 바이러스 분리용 시료로 사용한다.


2. SeV의 확인

(1) 혈구응집반응 (HA test)

바이러스가 증폭된 SPF란의 장뇨막강액을 원심분리한 후 얻어진 상층액을 원액부터 2배수로 계단 희석하여 96-well plate에 50ul씩 분주한다. Chicken RBC를 멸균 PBS에 희석하여 0.5% 용액을 만든 후, 50ul 씩 바이러스 액이 분주된 well에 첨가한다. 상온에서 2시간 반응 후 응집여부를 확인한다 (그림 2).

 

그림 2. 바이러스가 증폭된 SPF란의 Allantoic fluid의 HA titer 측정.


(2) RT-PCR

바이러스가 증폭된 SPF란의 장뇨막강액 1ml을 채취한 후, Trizole을 이용하여 RNA를 추출 한다 (참조: Microbial Pathogenesis, 2004, 37: 87-94).

cDNA 는 GeneAmp RNA PCR Core kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 1 ug 의 total RNA에서 합성 한다 (참조: Microbial Pathogenesis, 2004, 37: 87-94).

PCR 은 바이오니아의 premixed PCR tube를 이용하며, 아래와 같은 SeV 특이 primer 를 10pm 이용하여 수행한다(그림 3. J Gastroenterol 1998; 33:147-152).


그림 3. SeV 진단에 사용되는 Primer set.


(3) ELISA 를 이용한 진단 방법

시판용 Sendai virus detection kit를 이용하여 혈청검사를 한다. 시험방법은 하기와 같다.

① 검사 동물로부터 채혈된 혈액을 3000rpm에서 30분간 원심분리하여 혈청을 분리한다.

② 혈청을 PBS와 5% skim milk를 이용하여 희석 (1:5×1:12=1:60)하여 50ul 씩 각 well에 분주한 후 37℃ wet chamber에서 45분간 반응 시킨다.

  [예) (10ul+40ul) in PBS → (20ul+220ul) in 5% skim milk]


③ 각 well의 용액을 버린 후, 0.05% T-PBS 100ul 를 각 well에 분주하고  200~400 rpm에서 3분간 흔들어 세정한다. 3회 반복한다.


④ 이차항체를 anti-mouse IgG conjugated with HRP 또는 anti-rat IgG conjugated with HRP를 1:5000으로 PBS에 희석한 후, 각 well당 100 ul씩 분주한 후, 37℃ wet chamber에서 45분간 반응시킨다.

⑤ 각 well의 용액을 버린 후, 0.05% T-PBS 100ul 를 각 well에 분주하고  200~400 rpm에서 3분간 흔들어 세정한다. 3회 반복한다.

⑥ 상층액을 버린 후 100ul OPD를 각 well에 분주한 후, 차광하여 실온에서 10~20분 발색한다.

⑦ ELISA reader를 이용하여 OD450nm에서 흡광도를 측정한다.

⑧ 판정은, 측정된 OD값을 이용하여, 다음과 같은 기준으로 수행한다.

(net socre = antigen coated/0.13 - tissue control/0.13)

  net score 0, 1 : negative

  net score 2    : borderline

  net score 3, >3 : positive