1. 양성 혈청

ELISA법 확립을 위한 Sendai virus양성 혈청은 다음과 같다.

(1) 상용 양성혈청

시판하는 것을 구입한다.

(2) 8주 감염시험 동물의 혈청

SeV 에 대해 음성인 암컷 4주령 BALB/c mice 4마리를 구입하여, 각각의 마우스에 대하여 바이러스가 배양된 SPF란의 장뇨막강액 50ul (28 HA titer)를 5분 간격으로 5회에 나누어 비강접종 한다.

동일한 방법으로 4주 후 재 감염시키며, 이 후 4주째에 채혈하여 혈청을 수거한다.

(3) 상용 ELISA kit검사결과 양성동물의 혈청

시판용 ELISA kit를 이용하여 검사하였을 때, SeV에 양성을 나타낸 개체의 혈청을 양성 혈청으로 사용한다.


2. ELISA법에 이용할 항원량의 결정

(1) Sendai virus 항원

ATCC VR-105 바이러스주를 구입하여, 2CEID용량의 바이러스를 10일령 SPF수정란의 장뇨막강내에 접종시켜 48~72시간 배양시킨 후, 장뇨막강액 (약 27~29 HA titer / 50 ul)을 회수한다. 바이러스가 배양된 장요막강액을 3000g로 30분간 원심하여 계태아 조직등의 이물을 제거한 후, 상층액을 취하여, 60 % (w/v) sucrose 2.5ml 위에 30% (w/v) sucrose 3.5ml 을 중층시킨 원심 tube 위에 바이러스액 5ml을 조용히 중층시키고 5'C에서 90분간 100,000g로 초원심분리하여 (Beckmann sw-28 rotor), 60%와 30%의 sucrose층 사이에 보이는 SeV를 회수한다. 이렇게 일차 정제한 SeV를 Phosphate buffered saline(PBS)로 5ml이 되게 희석하여 NVT-90 rotor를 이용하여 90분간 100,000g에서 초원심 분리하여 바닥에 침전킨다. 상층액을 버리고 침전된 바이러스를 멸균 PBS 500ul에 희석하여 수거한다.

HA titer를 측정하였을 때 약10*28 titer / 50ul의 농도의 바이러스가 정제된다. 이렇게 수거한 바이러스는 실험에 사용하기 전까지 -70'C의 냉동고에 보관한다.

 

(2) Sendai virus의 흡착

96-well ELISA plate의 각 well에 흡착용 완충액 (CBB)로 희석한 (29 HA titer/50ul에서 2배 계단 희석) 바이러스 액 50ul를 각각 분주하고, 4℃ 냉장 상태에서 약 12시간 동안 정치하여 흡착시킨다. 흡착이 완료된 각 well은 PBS 100ul 로 3회 세정한 후 PBS에 희석시킨 1% bovine serum albumin를 100 ul 씩 각 well에 분주하여 1시간 동안 blocking 한다.

얻어진 양성 혈청을 각각 가로줄로 1:20부터 2배수로 serial 희석하여 각 well에 100 ul 씩 분주하여 실온에서 2-4 시간 동안 반응시킨다. 0.05% tween-PBS (T-PBS)를 이용하여 동일한 방법으로 5분간 3회 washing 하였고, rabbit polyclonal anti-mouse IgG with HRP를 1:10,000으로 희석한 2차 항체를 100 ul 씩 각 well에 분주하여 실온에서 2 시간 반응시킨다. T-PBS를 이용하여 5분간 5회 세정하고 o-Phenylenediamine (Sigma, USA)으로 발색한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정한다(Techan’s Sunrise Absorbance Microplate Reader, Phenix Research Products, Hayward, CA, USA).


 (3) 항원농도의 결정

각각의 항원 항체 비율에 따른 ELISA 결과를 그래프로 나타낸 결과, 항원 농도가 HA 28 titer / well 일 때, 혈청 희석배율 1000배 이하에서 적정값으로 나타났다. 또한, 상용 ELISA kit에서 제시하는 방법 (2절 2-(2) 참조)으로 ELISA를 수행하였을 때에도 동일한 결과를 나타내었다 (그림 4). 따라서 각 well당 항원농도가 HA 28 titer일 때를 ELISA 법에 이용할 항원 농도로 결정하였다.


그림4. ELISA법에 이용할 항원 농도의 결정


(4) 상용 ELISA kit와의 비교를 통한 sensitivity 조사

국내 실험동물 사육장의 Sendai virus 감염실태를 알아보기 위하여 일반사육장 1개소, SPF 사육시설 4개소 (A, B, C, D, E)에서 총 61마리의 마우스에 대한 검사를 수행하였는데 (Table 1), 상용ELISA kit (Charles river) 와의 sensitivity를 비교하였다 (Table 2).


Table I. Technical variation and the cut-off absorbance of ELISA (n=61) a

 ELISA

 Absorbance at 450 nm

 Methods

Maximum

Minimum

Mean

SD

No. of animals

Cut-off

 Positive

 1.169

0,494

0,7655

0,187

11

0.403

 Negative

 0,157

 0,058

 0,091

 0,027

 50

 

Blank

 0,057

 0,043

 0,054

 0,005

 

 

a  Total 61 animals were tested with coated 28 SeV HA titer and 80 folds diluted sera.

b Negative well: coated with the virus antigen and incubated with SeV-free micesera.

c blank well: coated with the virus antigen but incubated with 5% skim milk instead of serum samples.


Table II. Diagnostic accuracy compared to commercial ELISA kit a

ELISA results

 Animal

 facilities

 Positive

Intermediated

Negative

 (O / C)

  (O / C)

  (O / C)

 A

 8 / 8

0 / 0

 2 / 2

 B

 0 / 0

 0 / 0

 14 / 14

 C

 0 / 0

 0 / 0

 21 / 21

 D

 3 / 3

 0 / 0

 2 / 2

 E

 0 / 0

 0 / 0

 11 / 11


a  Total 61 micewere tested with coated 28 SeV HA titer and 80 folds diluted sera.

The O and C indicated the number of samples, which tested by our ELISA kit andcommercial ELISA kit, respectively.


본 실험에서 제작된 ELISA kit의 음성과 양성의 range는 표1에서와 같으며, 상용ELISA kit와 비교하여 결과를 판독하였을 때 61개체 모두에서 일치하는 결과를 얻었다.